新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）大流行導(dǎo)致了公共衛(wèi)生危機(jī)和全球恐慌，到目前為止確診人次已經(jīng)超過(guò)二億二千萬(wàn)例。Delta、Lambda新冠變異病毒已經(jīng)出現(xiàn)在全球90多個(gè)國(guó)家。如何快速準(zhǔn)確診斷病毒特別是變異株，對(duì)治療和防疫工作具有重要意義。逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）是國(guó)內(nèi)應(yīng)用最廣泛的新冠檢測(cè)技術(shù)。在疫情防控工作中，不同的核酸檢測(cè)技術(shù)也得到了快速的發(fā)展，包括數(shù)字PCR（dPCR），逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增（TMA）等。dPCR是一種新興的核酸擴(kuò)增技術(shù)，允許絕對(duì)定量核酸。它具有靈敏度高、精度高、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
01 什么是數(shù)字PCR
數(shù)字PCR技術(shù)也稱為第三代PCR技術(shù)，是一種核酸高靈敏檢測(cè)和絕對(duì)定量的新方法。同傳統(tǒng)的PCR相比，數(shù)字PCR增加了對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行分隔（Partition）的操作，將幾十微升的反應(yīng)體系分隔成了數(shù)萬(wàn)微小獨(dú)立反應(yīng)體系，核酸模板在這種分隔過(guò)程中被充分稀釋，理想狀態(tài)下每個(gè)微滴中含有1個(gè)分子的核酸模板，擴(kuò)增完成后對(duì)所有的液滴進(jìn)行熒光信號(hào)識(shí)別并計(jì)數(shù)，計(jì)算出陰性和陽(yáng)性反應(yīng)的數(shù)量，通過(guò)泊松分布原理計(jì)算靶標(biāo)分子的濃度。從而實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)分子的絕對(duì)定量。數(shù)字PCR不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，并且不受PCR擴(kuò)增效率影響，具有更高靈敏度和準(zhǔn)確度。
02 數(shù)字PCR的由來(lái)
◇ 2003年，Kinzler和Vogelstein繼續(xù)完善dPCR，并創(chuàng)建了一種改進(jìn)的方法，他們將其稱為BEAMing技術(shù)，即“珠子，乳狀液，擴(kuò)增和磁性”的首字母縮寫。BEAMing技術(shù)使用乳狀液在單個(gè)試管中分隔擴(kuò)增反應(yīng)。這一變化能在一次運(yùn)行中將該P(yáng)CR擴(kuò)展到成千上萬(wàn)的反應(yīng)。
隨著納米制造技術(shù)和微流體技術(shù)（nanofabrication and microfluidics）的發(fā)展，數(shù)字PCR技術(shù)遇到了突破瓶頸的最佳契機(jī)。
◇ 2006年，F(xiàn)luidigm公司推出了第一臺(tái)商業(yè)化的基于芯片的商品化數(shù)字PCR系統(tǒng)，F(xiàn)luidigm的IFC平臺(tái)使用物理矩陣的策略，他們的qdPCR 37K系統(tǒng)“集成電路”利用該公司的微流控專長(zhǎng)，可將48個(gè)樣品逐個(gè)分布在770個(gè)微反應(yīng)單元中。
◇ 2013年，Life technologies推出了QuantStudio3D數(shù)字PCR系統(tǒng)。采用高密度的納升流控芯片技術(shù)，樣本均勻分配至20000個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)孔中。在整個(gè)工作流程中，樣本之間保持完全隔離，可以有效防止樣品交叉污染，減少移液過(guò)程，簡(jiǎn)化操作步驟。同時(shí)芯片式設(shè)計(jì)避免了微滴式系統(tǒng)可面臨的管路堵塞問(wèn)題。
◇ 目前，dPCR的基本方法都已經(jīng)建立，根據(jù)反應(yīng)單元的不同形式，主要可分為微板式、微腔式和微滴式三大類系統(tǒng)。目前，市場(chǎng)上主要的數(shù)字PCR產(chǎn)品主要是基于微滴式和芯片式，如Bio-Rad公司的QX200微滴式系統(tǒng)和Thermo Fisher公司的Quant Studio系統(tǒng)等。
03 數(shù)字PCR的優(yōu)勢(shì)
數(shù)字PCR是生命科學(xué)領(lǐng)域最引人矚目的創(chuàng)新之一。與其他傳統(tǒng)分子診斷技術(shù)相比，數(shù)字PCR技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于:
? 高靈敏度，可實(shí)現(xiàn)單分子級(jí)檢測(cè)
dPCR本質(zhì)上將一個(gè)傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)變成了數(shù)萬(wàn)個(gè)PCR反應(yīng)， 在這數(shù)萬(wàn)個(gè)反應(yīng)單元中分別獨(dú)立檢測(cè)目的序列，從而大大提高了檢測(cè)的靈敏度。
? 高精度，可檢測(cè)微小差異
在大量野生型基因存在的情況下精準(zhǔn)地檢測(cè)低含量的突變基因是目前的研究難點(diǎn)之一，競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)嚴(yán)重影響突變基因的檢測(cè)。dPCR技術(shù)從背景序列中檢測(cè)低豐度目的序列的能力和高靈敏度的特點(diǎn)使得這一技術(shù)特別適合在復(fù)雜背景中檢測(cè)稀有突變。
? 絕對(duì)定量，不依賴標(biāo)準(zhǔn)品和參考曲線
數(shù)字PCR直接計(jì)算目的序列的拷貝數(shù)，無(wú)需依賴于Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以進(jìn)行精確的絕對(duì)定量檢測(cè)。
? 高重復(fù)性，消除擴(kuò)增效率偏差影響
FAM、HEX和Cy5通道濃度平均值和CV值的數(shù)據(jù)表明， 在所述的實(shí)驗(yàn)條件下，三種測(cè)試濃度之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差 異(p<0.05)。
? 強(qiáng)耐受抑制物，適用于多種復(fù)雜樣本
血液、糞便、食品、土壤等樣本中含有大量PCR反應(yīng)的抑制物，極大地影響 了PCR反應(yīng)效率。另外，在某些檢測(cè)中，難以制備測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線所需的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。dPCR不受PCR抑制物的影響、不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線的優(yōu)勢(shì)，使其特別適合于這些復(fù)雜樣本中基因表達(dá)的準(zhǔn)確定量檢測(cè)。
04 應(yīng)用領(lǐng)域
科學(xué)界對(duì)于數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性和結(jié)果可靠性的要求越來(lái)越高，更多的實(shí)驗(yàn)室將目光轉(zhuǎn)向擁有絕對(duì)定量方式、高靈敏度和高重復(fù)性特質(zhì)的數(shù)字PCR技術(shù)。dPCR作為一種新興的靶核酸絕對(duì)定量技術(shù)，對(duì)低豐度DNA具有高度的敏感性和特異性，對(duì)擴(kuò)增抑制劑具有高度的抗性。因此，dPCR可用于低拷貝病毒的檢測(cè)、病毒載量的測(cè)定、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備、環(huán)境中病毒濃度的監(jiān)測(cè)、病毒變異的檢測(cè)和SARS-CoV-2藥物的評(píng)價(jià)。
05 數(shù)字PCR應(yīng)用常見問(wèn)題
06 Vazyme可以提供
