1.那些年我們愛(ài)過(guò)的PCR之PCR技術(shù)發(fā)展歷程
遙想當(dāng)年，我們還是懵懂少年，在學(xué)校里無(wú)憂無(wú)慮的做實(shí)驗(yàn)。那會(huì)兒剛開(kāi)始接觸到聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），覺(jué)得這是一個(gè)神奇的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，可以把含量極少的DNA片段擴(kuò)增變成海量片段，從而輕而易舉的檢測(cè)出我們想要的目的基因片段。這個(gè)時(shí)候我們的狀態(tài)大概是這樣的：
然鵝，理想很豐滿，現(xiàn)實(shí)很骨感，做了一段時(shí)間PCR實(shí)驗(yàn)后我們發(fā)現(xiàn)會(huì)出現(xiàn)很多不太令人滿意的結(jié)果，比如這樣：
大家可能會(huì)問(wèn)，到底是哪里出了問(wèn)題？為什么會(huì)沒(méi)有預(yù)期的條帶？說(shuō)實(shí)話，這個(gè)問(wèn)題真是不太好回答，因?yàn)閷?dǎo)致PCR未擴(kuò)增或者非特異擴(kuò)增的因素很多，比如模板含有雜質(zhì)、退火溫度不合適、反應(yīng)體系不夠優(yōu)化等等。由于PCR或者準(zhǔn)確的說(shuō)終點(diǎn)PCR只能在反應(yīng)結(jié)束之后，通過(guò)凝膠電泳等方法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，不能反映整個(gè)PCR擴(kuò)增的實(shí)時(shí)狀態(tài)，因此很難判斷問(wèn)題到底出在哪。
這個(gè)時(shí)候，偉大的科學(xué)家們發(fā)明了熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)染料或者探針釋放熒光，實(shí)時(shí)監(jiān)控每一個(gè)PCR循環(huán)的熒光變化，最后生成擴(kuò)增曲線，如果是染料法，最后還可以生成熔解曲線，分析產(chǎn)物的特異性。怎么樣，是不是突然感覺(jué)柳暗花明又一村了。
然鵝，我們還是太年輕太天真，做了一段時(shí)間qPCR實(shí)驗(yàn)后我們發(fā)現(xiàn)檢測(cè)靈敏度不夠，沒(méi)法做絕對(duì)定量等等，似乎困難重重。
不要捉急，曙光就在眼前，下面讓我來(lái)為大家開(kāi)啟一扇新世界的大門(mén)，隆重歡迎PCR界的小鮮肉，數(shù)字PCR閃亮登場(chǎng)。
2.數(shù)字PCR橫空出世之dPCR檢測(cè)原理
數(shù)字PCR即Digital PCR（dPCR)是這幾年才迅速發(fā)展起來(lái)的一種核酸定量分析技術(shù)，雖然出生的晚，但是潛力不小，因?yàn)閿?shù)字PCR解決了qPCR這么多年懸而未決的問(wèn)題，那就是不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線的絕對(duì)定量并且可以將檢測(cè)靈敏度提高至單個(gè)核酸分子。那它是怎么做到的呢？這要從它的檢測(cè)原理說(shuō)起。數(shù)字PCR通過(guò)將一個(gè)樣本分成幾十到幾萬(wàn)份，分配到不同的反應(yīng)單元（微滴），包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的核酸分子(也就是說(shuō)我們所說(shuō)的 DNA 模板) ，這是與PCR或qPCR反應(yīng)最大的區(qū)別，PCR或qPCR只在一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行，而數(shù)字PCR在每個(gè)反應(yīng)單元（微滴）中都會(huì)對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后統(tǒng)計(jì)熒光信號(hào)并分析。是不是聽(tīng)起來(lái)特別高(yi)大(lian)上(meng)？舉個(gè)栗子，PCR或qPCR檢測(cè)突變像是在大海里撈一個(gè)會(huì)發(fā)光的針，周圍都是海水，很難看到針的光在哪，而dPCR就像把海水盛到好多個(gè)碗里面，瞧一眼很容易就知道哪個(gè)碗在發(fā)光了，而且，系統(tǒng)還會(huì)數(shù)出來(lái)到底有多少個(gè)碗里是發(fā)光的，多少個(gè)碗里是沒(méi)發(fā)光的，這樣一比，不就很容易的知道有多少數(shù)量的突變，就能做到絕對(duì)定量了。
舉了半天栗子，手都酸了，可能很多人還是會(huì)說(shuō)，道理我都懂，但是怎么做到的呢？
要知道，盡管dPCR的檢測(cè)和分析原理很早就被提出來(lái)了，但是無(wú)奈受限于當(dāng)時(shí)的技術(shù)條件，樣本稀釋與分配大多數(shù)都是靠手動(dòng)操作完成的，受到很多因素的干擾和限制。最重要的是，結(jié)果分析對(duì)于研究者來(lái)說(shuō)簡(jiǎn)直是噩夢(mèng)，十分的枯燥和繁瑣，他們的內(nèi)心應(yīng)該是拒絕的。
所以在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，dPCR的發(fā)展停滯不前，直到微流控技術(shù)與微納集成制造工藝給dPCR過(guò)程中幾個(gè)關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題提供了解決方案。簡(jiǎn)單說(shuō)來(lái)就是這兩項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展幫助dPCR研究與商業(yè)化平臺(tái)發(fā)展突破瓶頸。然后，正如我們看到的，全球多家生物醫(yī)療儀器公司在這個(gè)領(lǐng)域開(kāi)展了激烈的競(jìng)爭(zhēng)，也誕生了多個(gè)儀器設(shè)備，我們來(lái)看一下。
根據(jù)樣品稀釋分配方式不同，dPCR 技術(shù)可以分為三大類，一個(gè)是基于大規(guī)模集成微流控芯片（a），微反應(yīng)室/孔板（b）和微滴式（c）。
目前市場(chǎng)上常見(jiàn)的2款dPCR儀器QuantStudio 3D 和QX200分別是基于微反應(yīng)室（b）和微滴式（c）技術(shù)開(kāi)發(fā)的，兩者在檢測(cè)參數(shù)上略微有些差異，請(qǐng)看下面的表格。表1 兩款dPCR儀檢測(cè)參數(shù)對(duì)比
此外，兩者各自都有一些優(yōu)缺點(diǎn)，比如，QuantStudio 3D運(yùn)行需要ThermoFisher配套的芯片，但試劑可以通用；QX200運(yùn)行不需要芯片但是需要Bio-Rad配套試劑；QX200 需要多次移液操作，容易產(chǎn)生是微滴融合，QuantStudio 3D一次只能加載一張芯片，操作相對(duì)繁瑣等。3.dPCR不只是傳說(shuō)之?dāng)?shù)字PCR的應(yīng)用其實(shí)大家也不用太在意這么多可能連外星人都看不懂的檢測(cè)原理和對(duì)比分析，俗話說(shuō)得好，不看廣告看療效，是騾子是馬還得拉出來(lái)遛遛（偷笑）。數(shù)字PCR檢測(cè)其實(shí)離我們?cè)絹?lái)越近，下面我們以幾個(gè)臨床案例研究來(lái)舉例，展示數(shù)字PCR巨大的臨床應(yīng)用前景（敲黑板）。通過(guò)檢測(cè)T790M位點(diǎn)突變情況，可以更好地評(píng)估一代TKI藥物的療效及耐藥情況并指導(dǎo)第三代TKI靶向藥Osimertinib的使用。然而，由于qPCR平臺(tái)ARMS檢測(cè)技術(shù)的靈敏度有限，沒(méi)有辦法在含大量EGFR基因野生型背景核酸中高效準(zhǔn)確的檢測(cè)到T790M突變。這個(gè)時(shí)候dPCR技術(shù)展現(xiàn)出了無(wú)與倫比的檢測(cè)精度，此外，dPCR絕對(duì)定量的優(yōu)勢(shì)也能充分發(fā)揮出來(lái)了，可以監(jiān)控突變含量變化，做到及早發(fā)現(xiàn)耐藥[1]。伊馬替尼（Imatinib）可以有效幫助很多慢性髓細(xì)胞白血?。–ML）患者延長(zhǎng)生存期，但是臨床上發(fā)現(xiàn)，伊馬替尼的療效與BCR-ABL1融合基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物表達(dá)量有很大的關(guān)系。研究人員采用dPCR對(duì)CML患者的BCR-ABL1融合基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果檢測(cè)下限可以達(dá)到0.001%，顯示出dPCR在痕量核酸檢測(cè)方面比qPCR具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)[2]。(3).無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢查鐮狀細(xì)胞貧血（sickle cell anemia）是HBB基因突變引起的常染色體顯性遺傳病，有嚴(yán)重的危害，可以導(dǎo)致高達(dá)5%的胎兒死亡率及4.62%的孕婦死亡率。而精準(zhǔn)有效的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷是預(yù)防鐮狀細(xì)胞貧血患兒出生的有效方法。研究人員采用dPCR技術(shù)檢測(cè)孕婦胎兒游離DNA（cff-DNA）HBB基因突變。結(jié)果顯示，dPCR技術(shù)能夠確定87%的男性胎兒（n=45）和75%的女性胎兒（n=20）HBB基因的突變狀態(tài)。當(dāng)cff-DNA濃度大于7%時(shí)，可以100%的檢測(cè)出HBB基因突變[3]，可以說(shuō)是相當(dāng)厲害了。dPCR在其他很多領(lǐng)域，比如食品安全、環(huán)境微生物檢測(cè)等也有著廣泛的應(yīng)用，由于篇幅有限，這里就不在贅述了。最后再啰嗦一句，我們看到，隨著dPCR的誕生，古老的PCR技術(shù)又煥發(fā)出新的活力，我們期待dPCR能夠給精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展帶來(lái)新的動(dòng)力，解決更多臨床和科研面臨的難題，造福更多的人。
參考文獻(xiàn)
1. Oxnard G R, Paweletz C P, Kuang Y, et al. Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA[J]. Clinical cancer research, 2014, 20(6): 1698-1705.
2. Jennings LJ, George D, Czech J, et al.Detection and quantification of BCR-ABL1 fusion transcripts by droplet digital PCR.J Mol Diagn. 2014 Mar;16(2):174-9.
3. Barrett AN, McDonnell TC, Chan KC, Chitty LS. Digital PCR analysis of maternal plasma for noninvasive detection of sickle cell anemia. Clin Chem. 2012 Jun;58(6):1026-32.
注：文中漫畫(huà)引用于Sketching Science @Facebook，部分?jǐn)?shù)據(jù)引用于《數(shù)字PCR--原理、技術(shù)及應(yīng)用》一書(shū)。
