1999年，美國(guó)學(xué)者Kenneth Kinzler和BertVogelstein首次提出“數(shù)字PCR（digitalPCR，dPCR）”概念，該技術(shù)通過數(shù)數(shù)的方法，實(shí)現(xiàn)核酸分子的絕對(duì)定量。
圖1.數(shù)字PCR發(fā)展
在介紹數(shù)字PCR之前，首先和大家回顧一下熒光定量PCR技術(shù)（real time PCR,qPCR），也就是COVID-19檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。熒光定量PCR在操作流程上包括：a.核酸分子提??；b.RNA逆轉(zhuǎn)錄；c.熒光定量PCR檢測(cè)這三步驟。在檢測(cè)原理上熒光定量PCR主要包括兩種方法：a.染料法（SYBRGreen或Eva Green）；b.Taqman探針法。
數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）
數(shù)字PCR技術(shù)，是一種熒光定量PCR技術(shù)的升級(jí)技術(shù)。依然是利用染料法或Taqman探針法進(jìn)行的熒光檢測(cè)，不同的是dPCR是終點(diǎn)檢測(cè)熒光信號(hào)，qPCR是實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)。而數(shù)字PCR之所以是熒光定量的升級(jí)技術(shù)，主要是利用單分子擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)核酸的絕對(duì)定量。數(shù)字PCR將單個(gè)DNA分子置于獨(dú)立的反應(yīng)室中，并對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用TaqMan探針法或染料法檢測(cè)特定的靶序列。因此，數(shù)字PCR檢測(cè)主要包括三步：第一，通過特定技術(shù)將PCR反應(yīng)混合液分散到幾萬(wàn)個(gè)反應(yīng)單元（反應(yīng)室）；第二，單分子在反應(yīng)室中擴(kuò)增；第三，PCR結(jié)束后檢測(cè)熒光信號(hào)，最后通過泊松分布統(tǒng)計(jì)數(shù)數(shù)，計(jì)算出樣本的拷貝數(shù)，實(shí)現(xiàn)核酸分子的絕對(duì)定量。與qPCR相比dPCR的絕對(duì)定量不需要利用標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)定量，而是直接可以通過單分子擴(kuò)增結(jié)合泊松分布統(tǒng)計(jì)，既可實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。
因此，數(shù)字PCR與熒光定量PCR不同點(diǎn)，主要體現(xiàn)在數(shù)字PCR需要進(jìn)行分區(qū)后擴(kuò)增，而熒光定量PCR是不需要分區(qū)擴(kuò)增，而這種分區(qū)即可實(shí)現(xiàn)核酸分子的單分子擴(kuò)增，單分子擴(kuò)增既可以提高擴(kuò)增效率，同時(shí)可以提高熒光檢測(cè)的靈敏性和數(shù)據(jù)的可重復(fù)性。
圖2.數(shù)字PCR操作流程
數(shù)字PCR分區(qū)方法
數(shù)字PCR的主要核心點(diǎn)在于將PCR反應(yīng)液分區(qū)至數(shù)萬(wàn)微反應(yīng)單元，實(shí)現(xiàn)單分子擴(kuò)增。不同廠家利用不同方法實(shí)現(xiàn)核酸分子的分區(qū)，目前數(shù)字PCR分區(qū)方法主要包括3種：微流體數(shù)字PCR(Microfluidicdigital PCR，mdPCR)、微滴數(shù)字PCR(Dropletdigital PCR，ddPCR)和芯片數(shù)字PCR(Chipdigital PCR，cdPCR)。分別通過微流體通道、微液滴或微流體芯片實(shí)現(xiàn)分液，分隔開的每個(gè)微小區(qū)域都可進(jìn)行單獨(dú)的PCR反應(yīng)，其中mdPCR基于微流控技術(shù)，對(duì)DNA模板進(jìn)行分液，微流控技術(shù)能實(shí)現(xiàn)樣品納升級(jí)或更小液滴的生成，但液滴需要特殊吸附方式再與PCR反應(yīng)體系結(jié)合，mdPCR已逐漸被其他方式取代；ddPCR技術(shù)，是相對(duì)成熟的數(shù)字PCR平臺(tái)，利用油包水微滴生成技術(shù)，目前的儀器主要有Bio-rad公司的QX100/QX200微滴式dPCR系統(tǒng)和RainDance公司的RainDropTMdPCR系統(tǒng)，其中Bio-rad公司的dPCR系統(tǒng)利用油包水生成技術(shù)將含有核酸分子的反應(yīng)體系生成20000個(gè)納升級(jí)微滴，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，微滴分析儀逐個(gè)對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行檢測(cè)；cdPCR利用微流控芯片技術(shù)將樣品的制備、反應(yīng)、分離和檢測(cè)等集成到一塊芯片上，目前的儀器主要有Fluidigm公司的Bio-Mark™基因分析系統(tǒng)，Life Technologies公司的QuantStudio系統(tǒng)和JN Medsys公司的Clarity系統(tǒng)。利用集成流體通路技術(shù)在硅片或石英玻璃上刻上許多微管和微腔體，通過不同的控制閥門控制溶液在其中的流動(dòng)來實(shí)現(xiàn)生物樣品的分液、混合、PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。
在這里我們以杭州紐藍(lán)科技有限公司和JN medsys公司的芯片式數(shù)字PCR為例，帶大家觀看數(shù)字PCR如何實(shí)現(xiàn)核酸絕對(duì)定量。
dPCR與qPCR比較
實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以進(jìn)行絕對(duì)定量和相對(duì)定量，其中絕對(duì)定量是用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在相同的條件下目的基因測(cè)得的熒光信號(hào)量同標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，從而得到目的基因的量，標(biāo)準(zhǔn)品可選擇純化的質(zhì)粒DNA或體外合成的ssDNA等，其實(shí)qPCR的絕對(duì)定量是相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的定量，并非完全地絕對(duì)定量；相對(duì)定量通過內(nèi)參等進(jìn)行換算起始樣品中DNA的相對(duì)含量。數(shù)字PCR是基于傳統(tǒng)PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的第3代PCR技術(shù)，它不需要標(biāo)準(zhǔn)品，也不要制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，即能實(shí)現(xiàn)更靈敏、更準(zhǔn)確的絕對(duì)定量。同時(shí)，數(shù)字PCR是單分子擴(kuò)增技術(shù)，能夠有效避免反應(yīng)抑制劑的影響。隨著反應(yīng)室的增加，反應(yīng)受到抑制劑的影響就越小。
dPCR應(yīng)用
數(shù)字PCR明顯的優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于核酸檢測(cè)的方方面面。腫瘤液態(tài)活檢，遺傳生殖檢測(cè)，公共衛(wèi)生檢測(cè)，環(huán)境微生物檢測(cè)，RNA表達(dá)檢測(cè)，NGS文庫(kù)定量，甲基化檢測(cè)的等。后期將推出數(shù)字PCR具體的應(yīng)用，歡迎大家持續(xù)關(guān)注。也希望大家了解數(shù)字PCR后，能夠更好地解決目前難以解決的問題。
